Farbreaktion mit Ninhydrin
Prinzip:
Ninhydrin reagiert mit NH2-Gruppen unter Bildung eines blauen Farbkomplexes. Es reagieren also vor allem Aminosäuren, aber auch Peptide und Proteine, die naturgemäss mindestens eine freie
NH2-Gruppe besitzen.
Ausnahmen: Prolin, Hydroxyprolin und Cystein ergeben einen gelblichen Farbstoff.
Ausführung:
Je ein ml Probe und Ninhydrin mischen und 15 min in kochendem Wasser inkubieren (Denat) Resultate:
Farbnuancen von blau über violett und rot über hellbraun. Biuretprobe
Prinzip:
Proteine und Peptide bilden mit Cu2+ in alkalischer Lösung dunkelblau bis rotviolett gefärbte Komplexverbindungen, freie Aminosäuren jedoch nicht. Quantitativer sowie qualitativer
Test – gebräuchliche Eiweissbestimmungsmethode.
Ausführung:
Je ein ml Probe und Biuretreagenz bei ZT 15 min inkubieren. Fragen:
Spezifität – Empfindlichkeit von Ninhydrin bzw. Biuret?
Reaktion von Glutathion ? (Glutathion – Peptid aus Glycin, Cystein und Glutamat) Abtrennung von niedermolekularen Stoffen aus dem Serum
Dialyse
Prinzip:
Dialysemembran – Diffusion niedermolekularer Stoffe entlang Konzentrationsgradient, grössere Moleküle (Proteine) werden zurückgehalten Ausführung:
Cellophanschlauch mit Rinderserum gefüllt – Dialyse.
Nachweis in Aussenflüssigkeit durch / von
- Trichloressigsäure – Proteine?
- Salpetersäure – Proteine?
- Silbernitratlösung – Chlorid?
- Ninhydrin Farbreaktion – Aminosäuren, Peptide, Proteine?
Fragen:
Andere Prinzipien: Komplexbildung, Elektrophorese, Zentrifugation und Chromatographie.
Glukose diffundiert? – ja.
Wieso Fällung? – umgekehrte Reaktion des Salting in. Versuche mit Proteinen
Denaturierung
Proteine sind in nativer Form im energieärmsten Zustand. Ihre Struktur (Faltungsmodus) verleiht höchste Stabilität – hydrophile Gruppen aussen, hydrophobe Aminosäuren innen.
Denaturierung durch: Hitze, org. Lösungsmittel, pH, Komplexbildung oder Harnstoff.
Denaturierung bedeutet Veränderung der Sekundär-, Tertiär, und Quartärstruktur. Denaturierte Proteine haben die Tendenz, sich aneinanderzulagern – verschlechterte Löslichkeit,
d.h. Ausfällung.
Hitzefällung
Prinzip:
Hitze zerstört nicht-kovalente, intramolekulare Bindungen (H-Brücken, ionische Wechsel-wirkungen und van der Waalskräfte) – Verlust von Stabilität, d.h. Denaturierung. Resultat:
Albumin – kleines Plasmaprotein, bleibt auch löslich nach Denaturierung (intramolekulare Bindungen, z.B. Disulfidbrücken, bleiben bestehen).
Hizte ist ein schlechtes Fällungsmittel! Ausfällung durch Trichloressigsäure
Prinzip:
Bei der Denaturierung durch Säure werden die Ladungsverhältnisse verändert. Protonierung führt zur Bildung von positiven Ladungen, negative Ladungen verschwinden. Zudem Anlagerung
grosser anorganischer und organischer Anionen, wie z.B. TCA, senken Löslichkeit. Resultat:
Albumin – schwerlösliche Anlagerungsverbindung verursacht Niederschlag.
Säure ist stärkeres Fällungsmittel als Hitze. Bei Pepton aber trotzdem wirkungslos – zu klein. Reversible Fällung von Proteinen
Prinzip:
Löslichkeit von Proteinen variiert stark. Sie hängt ab von
- Art des Proteins
- pH
- Salzkonzentration
- Elektrostatische Wechselwirkungen
Globuläre Proteine (z.B. Albumin, Globulin) sind im allgemeinen gut, Faserproteine (z.B. Kollagen, Keratin) dagegen sehr schlecht löslich. Proteine mit vielen geladenen Gruppen zeigen im
allgemeinen gute Wasserlöslichkeit. Isoelektrische Fällung
Die Löslichkeit eines Proteinmoleküls ist am geringsten, wenn seine Gesamtladung gleich null ist, d.h. am isoelektrischen Punkt. Serumproteine haben unterschiedliche IEP, deshalb ist Fällung
eines einzelnen Proteins möglich.
Fällung durch Elektrolytkonzentration
- Salting out - Aussalzen: Hydrathülle wird den Proteinen streitig gemacht, sie fallen aus.
Vorteil: native Konformation der Proteine bleibt beim Aussalzen erhalten – Enzyme behalten ihre Aktivität.
Resultat: grosse Proteine fallen schon bei niedrigen, kleine erst bei hohen Salzkonzentrationen aus.
- Salting in – Einsalzen: Löslichkeitssteigernde Wirkung von Salzen, weil elektrostatische
Anziehungskräfte zw. Proteinen maskiert werden. Umgekehrt Ausfällung von Proteinen
nach Entfernung von Salzen (z.B. bei Dialyse). Achtung: Albumin fällt nicht aus! (Graphik)
Allgemein beste Wirkung am isoelektrischen Punkt.
Fällung durch organische Lösungsmittel (Alkohol od. Aceton)
Aenderung der Ladungs- und Hydratationszustände; organische Lösungsmittel sind apolar.
Fällung durch Komplexbildung mit Schwermetallionen (Zn, Cu, Ag etc.)
Fällende Wirkung von Schwermetallkationen auf Proteine.
Fragen:
- Auswirkungen von Reaktionen im Ueberschuss?
- Was geschieht beim Sauerwerden der Milch? – erreichen des isoelektrischen Punktes (Laktatbildung durch Bakterien).
- Gelatine? – denaturiertes Bindegewebe (Kollagen).
- Wodurch ist leichtere Ausfällbarkeit der Globuline im Vergleich zu Albumin zu erklären? Globuline wie Albumine sind globuläre
Proteine, aber Globulin ist grösser.
- Warum ist die Fällung durch TCA irreversibel und die durch Ammoniumsulfat reversibel? TCA zerstört native Form, Salting out schont Proteine.
- Trennung von Proteinen und Fällungssalz
nach Aussalzung? – Verdünnen, Dialyse, Komplexbildung.
- Verdünnung von Humanserum mit destilliertem Wasser führt zu Ausfällung, wieso? Entgegengesetzte Reaktion von Salting
in. Globuline fallen aus, Albumine nicht (Graphik)
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