Grundlagen:
- Beeinflussende Faktoren: Feldstärke, Nettoladung (bei bestimmtem pH), Grösse und Form der wandernden Partikel, Beschaffenheit des Trägers und Temperatur.
- Isoelektrischer Punkt: Nettoladung
gleich null.
- Träger: Gel aus Cellulose, Celluloseacetat, Stärke, Agar oder Polyacrylamid
- Cellulose-Acetat trennt Proteine in ihrer nativen Form (Tertiär- und Quartärstruktur bleiben intakt).
- Quantitative Messung der Serumproteine nach Elektrophorese durch Anfärbung der
Proteine mit Farbstoff (z.B, Ponceau S oder Aminosschwarz-Färbelösung) und photo-metrischer Messung
der Farbintensität (relative Proteinkonzentration im Vergleich zu Gesamtfläche des Diagramms – Gesamtproteingehalt messbar z.B. mit Biuret-Methode)
- pH = 8,6 – alle Serumproteine
haben negative Ladung und wandern Richtung Anode
- Menschliche Serumproteine werden durch Elektrophorese bei pH = 8,6 auf Cellulose-acetat in 5-6 Banden aufgetrennt: Albumin; a1-, a2-, b1-, b2-
und g-Globuline. Fibrinogen (Blutplasma) liegt zwischen b- und g-Globulinen.
Funktionsspektrum - Krankheitsbilder:
- Erhöhte g-Globulin-Fraktion – Diagnose: Antikörper-produzierende Tumoren
- Erniedrigung der Albumin-Fraktion – Diagnose: akute Entzündungen
- Spezielle Elektrophorese trennt abnormes Hämoglobin (z.B. HbS oder glykosyliertes Hb bei Diabetes mellitus) von normalem
HbA
- Unterscheidung von Isoenzymen
- Reinigung und Isolierung von Proteinen (Reinheitskriterium – homogenes Band!).
Anmerkungen:
- Proteinkonzentration im Serum normal: 65 – 80 g/L
- Proteinkonzentration im Liquor normal: 150 – 450 mg/L
- Proteinkonzentration im Harn normal: weniger als 70 mg/L
Quantitative Serumproteinmessung nach Bradford
Theoretische Grundlagen
Sehr schnelle, aber auch sehr sensible Methode – Detektionsgrenze: 1 mg, erlaubt Proteinmessung im Liquor cerebrospinalis oder im Urin. Biuret-Detektionsgrenze liegt bei 1mg! Andere Möglichkeit,
kleine Quantitäten zu messen, ist Suspensions-Photometrie (Reflexion, Absorption und Refraktion des Lichtes an den Teilchen wird gemessen)
Io = I absorbiert + I trans + I abgelenkt
Die Extinktion ist der Proteinmenge in der Lösung proportional! Prinzip der Messung:
Coomassie Blau (im Bradfordreaktiv) bindet an die hydrophoben Stellen der Proteine. Dabei verschiebt sich das Absorptionsmaximum. Die Absorption am neuen Maximalwert ist der Proteinkonzentration
direkt proportional.
Standartkurve aufstellen mit gleichem oder ähnlichem Protein, um nachher Werte ablesen zu können.
SDS-PAGE
(Sodium-Dodecyl-Sulphat – Polyacryl-Amid-Gel-Elektrophorese) Theorie der einfachen Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE):
- Polyacrylamid-Gel für Peptide, Proteine und Nucleinsäuren
- Porengrösse lässt sich wählen bei der Gel-Polymerisation, erlaubt sensiblere Auftrennung unterschiedlich
grosser Partikel.
- Bei einer gegebenen Porengrösse, hängt die Wanderungsgeschwindigkeit von der Ladung des Teilchens ab (pH-abhängig!), von seiner Grösse und seiner Form.
Am isoelektrischen Punkt wandert das Teilchen nicht. Gleiche Prinzipien wie bei der Elektrophorese auf Celluloseacetat (Versuch 1).
- PAGE wird häufig verwendet, um mehrere Messungen parallel
laufen zu lassen (Standart + Analyse) – Anwendung: Nukleinsäure-Sequenzierung.
Theorie der SDS-PAGE:
Proteine werden Hitze-denaturiert und mit einem negativ geladenen Detergens (SDS) gemischt (negativ geladener Mantel um Proteine!) – amphiphiles Detergens! Die negative Ladung ist proportional
der Grösse der Proteine. Somit spielt native Ladung des Proteins keine Rolle mehr, nur noch dessen Molekulargewicht ist ausschlaggebend für die Wanderungsgeschwindigkeit.
Durch spezielle Reduktionsmittel (z.B. Mercaptoethanol) können Disulfidbrücken gelöst werden, um auch Untereinheiten der Proteine voneinander zu trennen (Antikörper!). Hitze-Denaturierung
für Disulfidbrücken zu schwach.
Grosse Proteine wandern am wenigsten weit. Die Ladung pro Oberfläche ist überall gleich gross, deshalb Trennung allein durch Grösse – Retention durch die Poren. Sehr stabile
Proteine erscheinen ev. zu schwer, da Oberflächenladung im Vergleich kleiner ist, weil nicht die ganze Oberfläche zugänglich ist.
Proteine werden nach Trennung mit Coomassie Blau angefärbt. Keine Färbung wenn Blotting!
Anmerkungen:
- α-Globulinfraktion enthält a-Lipoproteine (HDL)!
- β-Globulinfraktion enthält b-Lipoproteine (LDL)!
- γ-Globuline enthalten sämtliche Antikörper: IgG, IgA, IgM, IgD und IgE.
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